qPCR एक परिष्कृत तकनीक है जिसका उपयोग PCR का उपयोग करके नमूने में DNA की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है। qPCR का पूर्ण रूप क्वांटिटेटिव पोलीमरेज चेन रिएक्शन है। हालांकि यह एक उन्नत प्रक्रिया है, हम Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण कर सकते हैं। इस लेख में, हम आपको Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण करने के दो तरीके प्रदर्शित करेंगे। यदि आप उनके बारे में जानने के लिए उत्सुक हैं, तो हमारा अभ्यास वर्कबुक डाउनलोड करें और हमें फॉलो करें।
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qPCR विश्लेषण क्या है?
qPCR या क्वांटिटेटिव पोलीमरेज चेन रिएक्शन एक परिष्कृत तकनीक है जिसका उपयोग PCR (पोलीमरेज चेन रिएक्शन) का उपयोग करके नमूने में DNA की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है। qPCR डेटा का विश्लेषण करने के दो तरीके हैं।
डबल डेल्टा Ct विधि
2001 में, Livak और Schmittgen ने इस विश्लेषण प्रक्रिया को डबल डेल्टा Ct विधि कहा। यह Pfaffl विधि का एक विशिष्ट मामला है। इस विधि के अनुसार, हमें प्रायोगिक डेटा के दो औसत सेट (जीन टेस्टेड एक्सपेरिमेंटल और हाउसकीपिंग जीन एक्सपेरिमेंटल) और नियंत्रण डेटा (जीन टेस्टेड कंट्रोल और हाउसकीपिंग जीन कंट्रोल) इनपुट करने होंगे। इन मूल्यों का उपयोग करके, हमें क्रमशः ∆CTE और ∆CTC के मान मिलेंगे।
∆CTE का मान जीन टेस्टेड एक्सपेरिमेंटल (TE) और हाउसकीपिंग जीन एक्सपेरिमेंटल (HE) के कटौती मूल्य को दर्शाता है। ∆CTE की सामान्य अभिव्यक्ति है:
इसी तरह, ∆CTC का मान जीन टेस्टेड कंट्रोल (TC) से हाउसकीपिंग जीन कंट्रोल (HC) के कटौती मूल्य को दर्शाता है। इस पद का गणितीय व्यंजक है:
उसके बाद, हमें ∆∆Ct के मान का अनुमान लगाने की आवश्यकता है। ∆∆Ct के मान को निर्धारित करने का सूत्र है:
अंत में, हम जीन एक्सप्रेशन रेशियो का मूल्यांकन करेंगे। इस विधि के अनुसार, हम मान लेते हैं कि प्रायोगिक और नियंत्रण दोनों जीनों के लिए प्राइमर दक्षता 100% है। इस प्रकार, जीन एक्सप्रेशन रेशियो की अभिव्यक्ति है:
Pfaffl विधि
Pfaffl विधि qPCR विश्लेषण के लिए एक सामान्य विधि है। इस विधि में डबल डेल्टा Ct विधि के साथ समानताएं हैं। हालांकि, इस विधि में प्राइमर दक्षता का मान 100% नहीं है। यह कोई भी संख्या हो सकती है। आमतौर पर, यह मान हाउस कीपिंग जीन (HKG) और जीन ऑफ इंटरेस्ट (GOI) दोनों के लिए 90% से 110% के बीच रहता है। 2001 में, Michael Pfaffl ने इस विश्लेषण सूत्र को Nucleic Acids Research जर्नल में प्रस्तुत किया।
इस दृष्टिकोण में, हमें डेटा के दो सेट इनपुट करने होंगे। इस डेटा का उपयोग करके, हम उनका औसत मूल्य गणना करेंगे। फिर, हम नियंत्रण नमूनों के औसत का अनुमान लगाएंगे। इससे, हम ∆Ct का मान निर्धारित करेंगे। ∆Ct की अभिव्यक्ति है:
इसके अलावा, जीन एक्सप्रेशन रेशियो का विश्लेषण करने का गणितीय सूत्र है:
Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण करने के 2 आसान तरीके
इस संदर्भ में, हम तीन या पांच डेटा नमूनों के लिए qPCR डेटा का विश्लेषण करने जा रहे हैं। हम पहले डबल डेल्टा Ct विधि के लिए विश्लेषण करेंगे और फिर Pfaffl विधि प्रदर्शित करेंगे।
1. डबल डेल्टा Ct विधि के माध्यम से qPCR डेटा का विश्लेषण करें
डबल डेल्टा Ct विधि के माध्यम से qPCR डेटा का विश्लेषण करने के लिए, हम पांच DNA नमूनों का एक डेटासेट मानते हैं। इस विधि में, हमें प्रायोगिक जीन और नियंत्रण जीन दोनों के लिए PCR प्राइमर दक्षता का मान 100% मानना होगा। हम यह भी दावा कर सकते हैं कि यह Pfaffl विधि का एक विशिष्ट मामला है। चरण निम्नानुसार विश्लेषण करेंगे:
📌 चरण:
- सबसे पहले, छवि में दिखाए अनुसार सभी जीन मूल्यों को सटीक रूप से इनपुट करें। हमें जीन टेस्टेड एक्सपेरिमेंटल (TE) और हाउसकीपिंग जीन एक्सपेरिमेंटल (HE) के सभी प्रायोगिक मूल्यों को कॉलम B और C में इनपुट करना होगा। इसी तरह, जीन टेस्टेड कंट्रोल (TC) और हाउसकीपिंग जीन कंट्रोल (HC) के सभी नियंत्रण मूल्यों को क्रमशः कॉलम D और E में इनपुट करें।
- अब, सेल F5 में, ∆CTE का मान गणना करने के लिए, निम्न सूत्र लिखें।
=B6-C6
- Enter दबाएं।
- इसी तरह, सेल G5 में ∆CTC का मान अनुमान लगाने के लिए, निम्न सूत्र लिखें।
=D6-E6
- फिर से, Enter दबाएं।
- फिर, सेल H5 चुनें और ∆∆Ct का मान प्राप्त करने के लिए निम्न सूत्र लिखें।
=F6-G6
- Enter दबाएं।
- अंत में, जीन एक्सप्रेशन रेशियो या 2^(−∆∆Ct) का मान गणना करने के लिए, सेल I5 में निम्न सूत्र लिखें।
=2^(-H6)
- अंतिम बार Enter दबाएं।
- उसके बाद, सेल रेंज F6:I6 चुनें।
- Fill Handle आइकन पर डबल-क्लिक करके पंक्ति 10 तक सूत्र कॉपी करें।
- आपको हर नमूने के लिए जीन एक्सप्रेशन रेशियो के मान मिल जाएंगे।
इस प्रकार, हम कह सकते हैं कि हमारी विधि पूरी तरह से काम करती है, और हम Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण करने में सक्षम हैं।
🔍 परिणाम की व्याख्या
सेल I5 में जीन एक्सप्रेशन रेशियो का मान 0.6507 का अर्थ है कि परीक्षित स्थितियों में जीन नमूने नियंत्रण स्थितियों के संबंध में सभी हमारे हाउसकीपिंग जीन के अनुसार सामान्यीकृत किए गए हैं। इसके अलावा, आप इसे प्रतिशत के रूप में मान सकते हैं। 0.6507 का अर्थ है हमारे नियंत्रण स्थिति के साथ हमारी परीक्षित स्थिति में 65.07% जीन अभिव्यक्ति।
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2. Pfaffl विधि का उपयोग करके qPCR का विश्लेषण करें
इस दृष्टिकोण में, हम Pfaffl विधि का उपयोग करेंगे। इस विधि और डबल डेल्टा Ct विधि के बीच मुख्य अंतर PCR प्राइमर दक्षता के मान में है जो प्रायोगिक जीन और नियंत्रण जीन दोनों के लिए 100% नहीं हैं। इस उदाहरण में, हम दोनों मामलों के लिए प्राइमर दक्षता मूल्यों को मान लेंगे। हाउस कीपिंग जीन नमूने के लिए, हम प्राइमर दक्षता का मान 93% मान रहे हैं, जबकि जीन ऑफ इंटरेस्ट के लिए यह मान 101% होगा। इस विधि के चरण नीचे दिए गए हैं:
📌 चरण:
- सबसे पहले, छवि में दिखाए अनुसार सभी जीन मूल्यों को सटीक रूप से इनपुट करें। हमें हाउस कीपिंग जीन (HKG) और जीन ऑफ इंटरेस्ट (GOI) के उपचारित और नियंत्रण दोनों जीन मूल्यों के दो सेट इनपुट करने होंगे। दोनों जीन सेट को क्रमशः Ct-1 और Ct-2 से दर्शाया गया है।
- पहले, हम हाउस कीपिंग जीन (HKG) खंड के लिए सभी गणनाएं पूरी करेंगे।
- अब, हम दोनों सेट का औसत मूल्य लेंगे। उसके लिए, हम AVERAGE फंक्शन का उपयोग करने जा रहे हैं।
- सेल E6 में निम्न सूत्र लिखें।
=AVERAGE(C6:D6)
- Enter दबाएं।
- फिर, सेल E11 तक सूत्र कॉपी करने के लिए Fill Handle आइकन पर डबल-क्लिक करें।
- उसके बाद, हमें तीन नियंत्रण मूल्यों के औसत का अनुमान लगाना होगा।
- उसके लिए, मर्ज किए गए F6 में निम्न सूत्र लिखें।
=AVERAGE(E9:E11)
- Enter दबाएं।
- अब, सेल G6 चुनें और ∆Ct का मान प्राप्त करने के लिए निम्न सूत्र लिखें। सेल F6 के लिए Absolute Cell Reference इनपुट करना सुनिश्चित करें।
=E6-$F$6
- फिर से, Enter दबाएं।
- फिर, सेल G11 तक सूत्र कॉपी करने के लिए Fill Handle आइकन पर डबल-क्लिक करें।
- हाउस कीपिंग जीन (HKG) के लिए हमारी सभी गणनाएं समाप्त हो गई हैं।
- इसी तरह, उसी प्रक्रिया का पालन करके जीन ऑफ इंटरेस्ट (GOI) खंड के लिए सभी गणनाएं पूरी करें।
- अंत में, सेल O6 में, एक्सप्रेशन रेशियो का मान प्राप्त करने के लिए निम्न सूत्र लिखें। सेल N6 और H6 के लिए Absolute Cell Reference सुनिश्चित करें।
=($N$6^M6)/($H$6^G6)
- अंतिम बार Enter दबाएं।
- अब, सेल O11 तक सूत्र कॉपी करने के लिए Fill Handle आइकन पर डबल-क्लिक करें।
- आपको हर नमूने के लिए एक्सप्रेशन रेशियो के मान मिल जाएंगे।
तो, हम कह सकते हैं कि हमारी विधि सफलतापूर्वक काम करती है, और हम Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण करने में सक्षम हैं।
निष्कर्ष
इस लेख का अंत यहीं होता है। मुझे आशा है कि यह लेख आपके लिए मददगार होगा और आप Excel में qPCR डेटा का विश्लेषण कर पाएंगे। यदि आपके पास कोई और प्रश्न या सुझाव हैं तो कृपया नीचे टिप्पणी अनुभाग में हमारे साथ साझा करें।
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